|
Λεπτομέρειες:
|
| Όνομα προϊόντων: | qPCR | Θερμοκρασία αποθήκευσης: | – 20 °C |
|---|---|---|---|
| Γερός και ενεργός για τη σύνθεση cDNA: | μέχρι 55°C. | Εφαρμογή: | PCR |
| Όγκος: | 1ml | Αντίστροφη μεταγραφή: | σειρά θερμοκρασίας (42-60°C) |
| Υψηλό φως: | Καθολικό TaqMan πολλαπλό QPCR,Πολλαπλό QPCR βιοχημικό αντιδραστήριο TaqMan,1ml TaqMan πολλαπλό QPCR |
||
Καθολικό κύριο μίγμα qPCR TaqMan πολλαπλό
Αρχές σχεδίου εγχυτήρων:
1. Το μήκος του προϊόντος ενίσχυσης συστήνεται για να είναι μεταξύ του σημείου ζέσεως 80-300
2. Μήκος εγχυτήρων: 18-25 σημείο ζέσεως
3. Το περιεχόμενο της βάσης G+C στους εγχυτήρες πρέπει να είναι μεταξύ 40%-60%
4. Η διαφορά αξίας του TM μεταξύ των μπροστινών εγχυτήρων και των αντίστροφων εγχυτήρων είναι λιγότερο από 2℃, και η αξία του TM μεταξύ 58-62℃ είναι το καλύτερο
5. Τυχαίο της διανομής βάσεων
6. Οι εγχυτήρες δεν πρέπει να περιέχουν τις μόνος-συμπληρωματικές ακολουθίες, διαφορετικά θα διαμορφώσουν μια δευτεροβάθμια hairpin δομή
7. Πρέπει να υπάρξουν όχι περισσότεροι από 4 συμπληρωματικές ή ομόλογες βάσεις μεταξύ δύο εγχυτήρων, διαφορετικά dimer εγχυτήρων θα διαμορφωθεί, ειδικά συμπληρωματική επικάλυψη " τέλος στα 3
8. Η " τελική βάση τα 3 του εγχυτήρα προτείνεται για να είναι Γ ή Γ
9. Κανένα άλλο μη συγκεκριμένο προϊόν δεν βρέθηκε στα αποτελέσματα σύγκρισης NCBI.
Εισαγωγή του καθολικού κύριου μίγματος qPCR TaqMan πολλαπλού:
Αυτό το προϊόν είναι μια λύση προμίξεων 2x για το qPCR που χρησιμοποιεί την πράσινη Ι ουτοπική μέθοδο φθορισμού GSK. Το τμήμα πυρήνων, πολυμεράση DNA Taq, είναι μια θερμότητα-ενεργοποιημένη πολυμεράση DNA που εμποδίζεται με τη μέθοδο αντισωμάτων, η οποία μπορεί αποτελεσματικά να εμποδίσει τη μη συγκεκριμένη ενίσχυση υπό τους όρους χαμηλής θερμοκρασίας. Εν τω μεταξύ, συνδυασμένος με τον απομονωτή αντίδρασης που βελτιστοποιείται για το qPCR, η πολυμεράση DNA Taq είναι πολύ κατάλληλη για την υψηλή αντίδραση ιδιομορφίας και ευαισθησίας qPCR. Μια καλή τυποποιημένη καμπύλη μπορεί να ληφθεί σε μια ευρεία ποσοτική περιοχή, η οποία είναι ακριβής, αναπαραγώγιμη και αξιόπιστη για την ποσοτική ανάλυση των γονιδίων στόχων. Συγχρόνως, αυτό το προϊόν περιέχει μια ειδική χρωστική ουσία αναφοράς ROX παθητική που είναι κατάλληλη για τη χρήση σε όλα τα όργανα qPCR, και δεν υπάρχει καμία ανάγκη να ρυθμιστεί η συγκέντρωση ROX στα διαφορετικά όργανα. Η μπλε χρωστική ουσία προστίθεται στην πρόμιξη, η οποία έχει την επίδραση ανιχνευτών της προσθήκης των δειγμάτων, και κίτρινο diluent προτύπων παρέχεται συγχρόνως. Όταν το πρότυπο αραιώνεται με κίτρινο diluent προτύπων και προστίθεται στην μπλε πρόμιξη αντίδρασης, το χρώμα αλλάζει από μπλε σε πράσινο, ο οποίος μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο ανιχνευτών κατά την προετοιμασία της διαδικασίας συστημάτων αντίδρασης και να αποτρέψει τη διαρροή ή το misaddition. Τα φάσματα των μπλε και κίτρινων χρωστικών ουσιών δεν επικαλύπτουν με τις χρωστικές ουσίες qPCR και δεν έχουν επιπτώσεις στα αποτελέσματα αντίδρασης.
Το πρωτόκολλο/οι διαδικασίες δοκιμής για καθολικό TaqMan πολλαπλασιάζει το κύριο μίγμα qPCR:
1. (Προαιρετική) διάλυση προτύπων:
Αυτή η εξάρτηση παρέχει έναν ΚΊΤΡΙΝΟ απομονωτή διαλύσεων προτύπων 40x, μια 40 αραιωμένη πτυχές κίτρινη διάλυση προτύπων που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ακριβώς να καθορίσει εάν το πρότυπο έχει προστεθεί στο ρευστό αντίδρασης qPCR με την αλλαγή του χρώματος του υγρού. Παίρνοντας το σύστημα αντίδρασης 20ul qPCR για παράδειγμα, σύμφωνα με το ποσό προτύπων διαλύσεων που προστίθεται στη λύση αντίδρασης 20ul qPCR, η αντίστοιχη μέθοδος διαλύσεων του αρχικού προτύπου μπορεί να αναφερθεί στον ακόλουθο πίνακα (που παίρνει το αρχικό πρότυπο που αραιώνεται σε 100ul για παράδειγμα):
| Προσθέστε το αραιωμένο πρότυπο στη λύση αντίδρασης 20ul qPCR (ul) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Προσθέστε τον ΚΊΤΡΙΝΟ απομονωτή διαλύσεων προτύπων 40x στο σύστημα διαλύσεων προτύπων 100ul (ul) | 50 | 25 | 16.7 | 12.5 | 10 | 8.4 | 7.2 | 6.3 |
| Προσθέστε το σύστημα διαλύσεων προτύπων 100ul στο αρχικό πρότυπο (ul) | Χ | Χ | Χ | Χ | Χ | Χ | Χ | Χ |
| όγκος της προσθήκης της νουκλεάσης - ελεύθερο νερό (ul) | 50-Χ | 75-Χ | 83,3-Χ | 87,5-Χ | 90-Χ | 91,6-Χ | 92,8-Χ | 93,7-Χ |
Παράδειγμα:
αραιωμένο το 2ul πρότυπο πρέπει να προστεθεί στο σύστημα αντίδρασης 20ul qPCR.
Παίρνοντας το σύστημα διαλύσεων προτύπων 100ul για παράδειγμα, όταν ο αρχικός όγκος προτύπων είναι 20ul, απομονωτής διαλύσεων προτύπων 25ul 40x ο κίτρινος προστίθεται, και έπειτα το νουκλεάση-ελεύθερο νερό 55ul προστίθεται στο συνολικό όγκο 100ul.
Ο ΚΊΤΡΙΝΟΣ ΑΠΟΜΟΝΩΤΉΣ ΔΙΑΛΎΣΕΩΝ ΠΡΟΤΎΠΩΝ 40x είναι τώρα 10x. Προσθέστε 2ul του αραιωμένου προτύπου σε έναν απομονωτή διαλύσεων διαλύσεων 20ul, και ο τελικός ΚΊΤΡΙΝΟΣ απομονωτής διαλύσεων προτύπων 40× είναι 1x. Συμπερασματικά, ο κίτρινος απομονωτής διαλύσεων προτύπων πρέπει να είναι 1x στο τελικό σύστημα qPCR.
Πληροφορίες προϊόντων του καθολικού κύριου μίγματος qPCR TaqMan πολλαπλού:
| Όνομα προϊόντων | Προσδιορισμός του προϊόντος | Πρότυπο |
| Καθολικό κύριο μίγμα qPCR TaqMan πολλαπλό | Gs-mbp0044-01 | 1ml |
| Gs-mbp0044-05 | 5×1 μιλ. | |
| Gs-mbp0044-15 | 15×1 μιλ. |
Οι όροι αποθήκευσης και χειρισμού με καθολικό TaqMan πολλαπλασιάζουν το κύριο μίγμα qPCR:
Υγρή μεταφορά τσαντών πάγου Αποθηκευμένος στη θερμοκρασία -20℃, έγκυρη για 12 μήνες.
Σημείωση: Εάν το πρότυπο δεν πρέπει να αραιωθεί, ή εάν diluent προτύπων g3362-2 δεν χρησιμοποιείται, μπορείτε να αγνοήσετε αυτό το βήμα.
2. PCRδιαδικασίααντίδρασης(μπορείνα ρυθμιστείσύμφωνα μεταόργανα):
α: Εάν η ιδιομορφία ενίσχυσης πρέπει να βελτιωθεί, η σε δύο στάδια διαδικασία ή η ανοπτώντας θερμοκρασία μπορεί να χρησιμοποιηθεί Για να βελτιώσει την αποδοτικότητα ενίσχυσης, μια σε τρία στάδια διαδικασία ή ένας χρόνος επέκτασης μπορεί να χρησιμοποιηθεί.
Σημείωση:
1. Παρακαλώ φορέστε τα μίας χρήσης γάντια για να αποφύγετε κατά τη λειτουργία RNase τη μόλυνση.
2. Τα αντίστροφα προϊόντα μεταγραφής μπορούν να αποθηκευτούν σε -20℃ για μια σύντομη περίοδο. Εάν η μακροπρόθεσμη αποθήκευση απαιτείται, συστήνεται να αποθηκευτούν σε -80℃ μετά από τη συσκευασία για να αποφύγει τους επαναλαμβανόμενους freeze-thaw κύκλους.
3. Εάν το πρότυπο είναι ευκαριωτικής προέλευσης, συστήνεται να επιλεχτεί ο οληγο (DT) εγχυτήρας 18 και να ζευγαρωθεί με την πολυ Α ουρά 3 " ευκαριωτικό mRNA για να λάβει την υψηλότερη παραγωγή του ολόκληρου cDNA.
4. Για την αντίστροφη μεταγραφή του prokaryotic RNA, ο τυχαίος εγχυτήρας Hexamer ή ο συγκεκριμένος εγχυτήρας γονιδίων πρέπει να χρησιμοποιηθεί.
5. Ο τυχαίος εγχυτήρας Hexamer έχει την ευρεία δυνατότητα εφαρμογής και είναι κατάλληλος για mRNA, rRNA, tRNA, το μικρά RNA και lncRNA τα πρότυπα.
6. Εάν η αντίστροφη μεταγραφή ακολουθείται από τη δοκιμή qPCR, ο οληγο (DT) εγχυτήρας 18 και ο τυχαίος εγχυτήρας Hexamer μπορούν να αναμιχθούν για να κάνουν cDNA την αποδοτικότητα σύνθεσης σε όλες τις περιοχές mRNA το ίδιο πράγμα, το οποίο βοηθά να βελτιώσει την αυθεντικότητα και την επανάληψη των ποσοτικών αποτελεσμάτων.
7. Εάν οι επόμενοι εγχυτήρες qPCR σχεδιάζονται στα εξόνια, το βήμα αφαίρεσης γονιδιώματος μπορεί να παραλειφθεί.
Κοινές προβλήματα και λύσεις:
| Περιγραφή προβλήματος | Πιθανοί λόγοι | Λύσεις |
| Στο τέλος της αντίδρασης, καμία καμπύλη ενίσχυσης δεν εμφανίστηκε ή η αξία CT εμφανίστηκε πάρα πολύ αργά | Η συγκέντρωση προτύπων είναι πάρα πολύ χαμηλή | Επαναλάβετε το πείραμα για να μειώσετε το πολλαπλάσιο διαλύσεων προτύπων, και αρχίστε από την υψηλότερη συγκέντρωση όταν η συγκέντρωση δειγμάτων είναι άγνωστη |
| Υποβάθμιση προτύπων | Το πρότυπο προετοιμάστηκε πάλι και το πείραμα επαναλήφθηκε | |
| Υπάρχουν PCR ανασταλτικοί παράγοντες στο σύστημα | Γενικά, το πρότυπο φέρεται μέσα, η αναλογία διαλύσεων του προτύπου αυξάνεται ή το πρότυπο με την υψηλή αγνότητα είναι και επανέλαβε | |
| Οι εγχυτήρες μπορούν να υποβιβάσουν | Οι εγχυτήρες που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί για πολύ καιρό πρέπει πρώτα να εξεταστούν για την ακεραιότητα από την ηλεκτροφόρηση ΣΕΛΙΔΩΝ για να αποκλείσουν τη δυνατότητα της υποβάθμισης | |
| Χαμηλή αποδοτικότητα ενίσχυσης | το ncrease η συγκέντρωση εγχυτήρων, δοκιμάζει μια σε τρία στάδια διαδικασία ενίσχυσης, ή ξανασχεδιάζει τον εγχυτήρα | |
| Το προϊόν ενίσχυσης είναι πάρα πολύ μακρύ | Το μήκος προϊόντων ενίσχυσης ελέγχθηκε στη σειρά του σημείου ζέσεως 80-300 | |
| Ο κενός έλεγχος παρουσιάζει το σήμα | Ρύπανση συστημάτων αντίδρασης | Αρχικά, το κενό νερό ελέγχου πρέπει να αντικατασταθεί. Εάν η ίδια κατάσταση εμφανίζεται ακόμα, οι εγχυτήρες, οι αναρροφητήρες και PCR οι σωλήνες πρέπει να αντικατασταθούν ή ένα νέο κύριο μίγμα πρέπει να αρχίσει. Το σύστημα αντίδρασης προετοιμάζεται σε έναν έξοχο καθαρό πίνακα για να μειώσει τη ρύπανση αερολύματος |
| Η μη συγκεκριμένη ενίσχυση όπως dimers εγχυτήρων εμφανίζεται |
Γενικά, είναι κανονικό για τα προϊόντα ενίσχυσης να εμφανιστούν στον κενό έλεγχο μετά από 35 κύκλους, οι οποίοι πρέπει να αναλυθούν με τη λειώνοντας καμπύλη. Ο εγχυτήρας επανασχεδιασμών, ρυθμίζει τη συγκέντρωση εγχυτήρων ή βελτιστοποιεί PCR τη διαδικασία αντίδρασης |
|
| Η λειώνοντας καμπύλη έχει τις πολλαπλάσιες αιχμές | Το σχέδιο εγχυτήρων είναι φτωχό | Ο νέος εγχυτήρας ξανασχεδιάστηκε σύμφωνα με τις αρχές σχεδίου εγχυτήρων |
| Η συγκέντρωση εγχυτήρων είναι πάρα πολύ υψηλή | Μειώστε τη συγκέντρωση εγχυτήρων κατάλληλα | |
| Υπάρχει genomic μόλυνση στο πρότυπο cDNA | Η αποσπασματική λύση RNA αφομοιώνεται χρησιμοποιώντας τα ένζυμα DNA, όπως DSDNase, για να αφαιρέσει τη genomic μόλυνση, ή για να σχεδιάσει transintron τους εγχυτήρες | |
| Φτωχή δυνατότητα αναπαραγωγής των πειραμάτων | Το λάθος της προσθήκης του δείγματος είναι μεγάλο |
Η χρήση του ακριβούς σιφωνίου, με υψηλό - επικεφαλής ακριβές σιφώνιο ποιοτικής αναρρόφησης Υψηλό πρότυπο διαλύσεων, που προσθέτει το μεγάλο πρότυπο όγκου για να μειώσει το λάθος δειγματοληψίας Ο όγκος αντίδρασης του qPCR διευρύνθηκε |
| Η συγκέντρωση προτύπων είναι πάρα πολύ χαμηλή | Επαναλάβετε το πείραμα για να μειώσετε τους χρόνους διαλύσεων του προτύπου | |
| Απόκλιση θερμοκρασίας στις διαφορετικές θέσεις του οργάνου qPCR | Βαθμολογήστε το όργανο qPCR τακτικά | |
| Η καμπύλη ενίσχυσης δεν είναι ομαλή | Το σήμα φθορισμού είναι πάρα πολύ αδύνατο, παραχθείς μετά από τη διόρθωση συστημάτων |
Εξασφαλίστε ότι οι χρωστικές ουσίες που προμιγνύονται στο κύριο μίγμα δεν υποβιβάζονται Αντικαταστήστε το φθορισμού σήμα για να συλλέξετε τα καλύτερα αναλώσιμα qPCR |
| Σπασίματα ή ολισθήσεις καμπυλών ενίσχυσης | Η συγκέντρωση προτύπων ήταν υψηλότερη και η αξία σημείου τέλους βασικών γραμμών ήταν μεγαλύτερη από την αξία CT | Το σημείο τέλους βασικών γραμμών (αξία -3 CT) μειώθηκε και τα στοιχεία αναλύθηκαν ξανά |
| Καμπύλες ενίσχυσης των μεμονωμένων φρεατίων που πέφτουν ξαφνικά αισθητά | Υπάρχουν φυσαλίδες στο σωλήνα αντίδρασης |
Εξασφαλίστε ότι το ΜΙΓΜΑ διαλύεται εντελώς, και μην στροβιλιστείτε και ταλαντευτείτε ομοιόμορφα Αφότου προστίθεται το δείγμα, οι φυσαλίδες αφαιρούνται από τη φυγοκεντρικότητα με το ελαφρύ ελαστικό. Ο χρόνος προ-αλλοίωσης παρατάθηκε σε 10 λ. για να αφαιρέσει τις φυσαλίδες |
Εάν χρειάζεστε περισσότερες πληροφορίες για το καθολικό κύριο μίγμα qPCR TaqMan πολλαπλό, παρακαλώ μας ενημερώστε on-line, σας ευχαριστεί.
Υπεύθυνος Επικοινωνίας: Ms Kris
Τηλ.:: +8613049739311
